La secuenciación de proteínas es la determinación de la secuencia de aminoácidos en una proteína.
Trataré de escribir una nota detallada sobre la secuencia de proteínas.
La estrategia habitual para determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína implica ocho pasos básicos.
- Si la proteína contiene más de una cadena polipeptídica, las cadenas se separan y purifican.
- Los puentes cruzados S-S (disulfuro) intracatenarios entre residuos de cisteína en la cadena polipeptídica se escinden. Si estos disulfuros son enlaces entre cadenas, entonces el paso 2 precede al paso 1.
- La composición de aminoácidos de cada cadena polipeptídica se determina.
- Los residuos N-terminal y C-terminal se identifican.
- Cada cadena polipeptídica se divide en fragmentos más pequeños.
- Determinación de la secuencia de fragmentos de péptidos.
- La secuencia de aminoácidos general de la proteína se reconstruye a partir de las secuencias en fragmentos superpuestos.
- Se ubican las posiciones de puentes cruzados S-S formados entre residuos de cisteína.
Separación de cadenas polipeptídicas:
Las asociaciones de subunidades en proteínas multiméricas se mantienen típicamente únicamente mediante fuerzas no covalentes, y por lo tanto la mayoría de las proteínas multiméricas se pueden disociar generalmente por exposición a pH extremos, urea 8 M, hidrocloruro de guanidinio 6 M o altas concentraciones de sal.
Escisión de puentes disulfuro
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La oxidación de un disulfuro por ácido perfórmico da como resultado la formación de dos equivalentes de ácido cisteico.
Identificación de los residuos N y C-terminales
Análisis N-Terminal:
El extremo amino terminal de la cadena polipeptídica se determina por cualquiera de tres métodos, a saber, el método de sangar, el método de Edmann y el método de cloruro de dansilo.
Degradación de Sanger:
En el método sanger, se usó fluorodinitrobenceno. El polipéptido reacciona con FNDB para formar un complejo de dinitrofenol con un polipéptido. El análisis posterior libera un aminoácido amino terminal marcado con dinitrofenol de color, que se puede identificar por su índice de migración característico en cromatografía de capa fina o electroforesis en papel.
Degradación de Edman:
En el método de degradación de Edman, se usa fenil isotio cianato (PIT) como reactivo. Primero, el polipéptido se trata con fenil isotiocianato para formar un derivado de polipeptidilfeniltiocarbamilo. La hidrólisis suave libera el aminoácido amino terminal como una feniltiohidantoína (PTH), que puede separarse y detectarse espectrofotométricamente.
Hasta esta etapa, este método se usa para determinar el aminoácido N-terminal.
La degradación de Sanger tiene la desventaja de que el residuo N-terminal solo se puede determinar y todos los demás residuos se hidrolizarán.
La degradación de Edman puede continuar más después de la primera secuenciación de residuos.
A continuación tenemos cloruro de dansilo
Este método es más sensible debido a la medición de fluorescencia.
C- Análisis Terminal:
Hay dos métodos usados para la determinación C-terminal. Son el método de la hidracina y el método de la carboxipeptidasa.
Las carboxipeptidasas son enzimas que escinden residuos de aminoácidos del extremo C de polipéptidos de forma sucesiva. Cuatro carboxipeptidasas son de uso general: A, B, C e Y.
La carboxipeptidasa A (del páncreas bovino) funciona bien en la hidrólisis del enlace peptídico Cterminal de todos los residuos excepto la prolina, la arginina y la lisina. La enzima análoga del páncreas de cerdo.
carboxipeptidasa B, es efectiva solo cuando Arg o Lys son los restos C-terminales. Por lo tanto, una mezcla de carboxipeptidasas A y B libera cualquier aminoácido C-terminal excepto la prolina.
La carboxipeptidasa C de las hojas de cítricos y la carboxipeptidasa Y de la levadura actúan sobre cualquier resto C-terminal.
Fragmentación de la cadena polipeptídica
El objetivo en este paso es producir fragmentos útiles para el análisis de secuencias. Los métodos de escisión empleados suelen ser enzimáticos, pero las proteínas también pueden fragmentarse por medios químicos específicos o no específicos (como la hidrólisis ácida parcial).
Reconstrucción de la secuencia global de aminoácidos
Las secuencias obtenidas para los conjuntos de fragmentos derivados de dos o más procedimientos de escisión se comparan ahora, con el objetivo de encontrar solapamientos que establezcan la continuidad de la secuencia de aminoácidos global de la cadena polipeptídica. Los péptidos generados a partir de hidrólisis específica del polipéptido se pueden alinear para revelar la secuencia de aminoácidos global.
Localizando los enlaces disulfuro
Si la estructura primaria incluye enlaces disulfuro, sus ubicaciones se determinan en un paso adicional después de que se completa la secuencia. Una muestra de la proteína se escinde nuevamente con un reactivo tal como tripsina, esta vez sin romper primero los enlaces disulfuro. Los péptidos resultantes se separan por electroforesis y se comparan con el conjunto original de péptidos generados por la tripsina. Para cada enlace disulfuro, faltarán dos de los péptidos originales y aparecerá un péptido nuevo y más grande. Los dos péptidos ausentes representan las regiones del polipéptido intacto que están unidas por el enlace disulfuro.
Técnica de superposición en la organización
La última imagen no está clara y eso explica la última parte de la disposición y secuencia de aminoácidos.
Gracias
