Resumen:
- Muchas proteínas termófilas son estables a altas temperaturas debido a las contribuciones entálpicas. Es decir, más enlaces de hidrógeno / puentes salinos / interacciones no covalentes [1,2].
- Los estados nativos de Taq y E. coli Pol I polimerasa son altamente homólogos.
- La estructura cristalina de Taq tiene interacciones más estables (o interacciones menos desfavorables) que la polimerasa E. coli Pol I, nada significativo para explicar la termoestabilidad [3].
- El hecho de que haya una similitud significativa en los estados nativos, pero disimilitud en la estabilidad, apunta a la participación de estados desnaturalizados .
- La entalpía plegada de la polimerasa Taq es menor que la de la polimerasa Pol I de E. coli . Taq es más estable debido a la menor penalización entrópica del plegado [4].
- ¿Qué significa “penalización entrópica reducida del plegado”? El estado desnaturalizado de E. coli Pol I podría ser más extenso o menos colapsado que el de Taq. O, Taq podría liberar más moléculas de agua mientras se dobla, disminuyendo así la penalización entrópica.
- ¿Por qué es relevante el estado desnaturalizado? porque la estabilidad de la proteína se basa en las diferencias de energía libre entre los estados nativo y desnaturalizado, no en un solo estado.
Prepárate, esta es una respuesta larga.
Debo admitir, asumí que Taq era estable a altas temperaturas, debido a más interacciones no covalentes. Mi primer pensamiento fue buscar las diferencias en la estructura y secuencia entre Taq polimerasa (TP) y E. coli Pol I polimerasa (EP).
Comparación de secuencia:
Tanto TP como EP tienen 3 dominios sin enlaces disulfuro. La eliminación del tercer dominio (dominio de 5 ‘nucleasas) nos dará los fragmentos Klentaq y Klenow. La mayoría de los estudios comparan los fragmentos Klentaq y Klenow, que son polimerasas activas con estructuras nativas muy similares.
Figura 1: Comparación de la secuencia de aminoácidos de las ADN polimerasas de T. aquaticus, E. coli y bacteriófago T7. [5]
Resulta que no hay demasiadas diferencias significativas entre las secuencias, TP tiene más argininas en lugar de lisinas, más glicinas en lugar de alaninas, más prolinas en lugar de alaninas y un ligero aumento en el contenido de residuos hidrofóbicos. Información no particularmente útil sin datos de estructura.
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Comparación de estructura:
- Los pliegues de Klentaq y Klenow son muy similares.
Figura 2: estructuras cristalinas superpuestas, Klentaq en gruesas y Klenow en líneas finas. [3]
- Aunque el terminal N de KlenTaq es ligeramente más estable, es imposible determinar si esto contribuye a la termoestabilidad.
Figura 3: comparaciones de energía entre estructuras cristalinas [3]
Estudios plegables:
Antes de revisar los resultados de un estudio reciente [4], me gustaría hablar sobre la estabilidad de la proteína y el papel de la entropía [6].
- Muchos ingenieros de proteínas intentan aumentar la estabilidad de su proteína de interés. Un truco en la comunidad de ingeniería de proteínas es mutar glicinas.
- Las glicinas carecen de carbono [matemático] \ beta [/ math] y tienen más flexibilidad de columna vertebral, o en otras palabras, entropía conformacional.
- Por lo tanto, se requiere más energía libre para restringir la conformación de glicina en una proteína plegada. Al reemplazar las glicinas con alaninas (por supuesto en las posiciones correctas), podemos aumentar la estabilidad de la proteína. Sí, también podría haber un efecto entálpico con la posibilidad de enlaces de hidrógeno, pero también estamos cambiando el estado desnaturalizado.
- Posteriormente, se pueden reemplazar residuos no ramificados con residuos ramificados (por ejemplo, isoleucina), o usar prolinas.
El concepto de que el estado desnaturalizado puede contribuir a la estabilidad de la proteína se conoce desde la década de 1970 [6-8].
Dependencia de temperatura de Klenow y Klentaq:
- La dependencia de la temperatura de entropía y entalpía de las dos proteínas se describe a continuación:
Figura 4: dependencia de la temperatura de la entalpía (Δ H ) y la entropía ( T Δ S ) del plegamiento de Klenow y Klentaq, calculada con la ecuación de Gibbs-Helmholtz. Todos los valores están en la dirección de plegado en esta gráfica. Todas las líneas azules muestran datos de Klenow, las líneas rojas muestran datos de Klentaq. Los valores ΔG se vuelven a trazar para comparar (líneas curvas, cóncavas arriba). Las líneas diagonales sólidas muestran T Δ S de plegamiento para cada proteína, las líneas diagonales discontinuas muestran Δ H de plegamiento. [4]
- De la figura anterior, puede ver que [math] \ Delta H_ {fold} [/ math] para Klenow es más favorable (o menos desfavorable) que Klentaq (es positivo para algunas temperaturas). ¿Qué significa esto? Puede haber menos interacciones no covalentes en el estado plegado de Klentaq o más interacciones en el estado desnaturalizado, o ambas, en comparación con Klenow.
- Del mismo modo, [math] T \ Delta S_ {fold} [/ math] para Klenow es más desfavorable que Klentaq. ¿Qué significa esto? Esto puede ser de dos fuerzas opuestas: (a) ganar entropía a partir de la liberación de agua [matemática] \ Delta S _ {hidratación} [/ matemáticas] durante el plegado, o (b) no perder mucha entropía conformacional desde el estado desnaturalizado al plegado [matemática ] \ Delta S_ {conformation} [/ math].
Aquí hay datos en [math] 37 ^ {\ circ} C [/ math], para una distinción más clara en el equilibrio de las fuerzas impulsoras:
Figura 5: valores de [math] \ Delta H_ {fold} [/ math], [math] T \ Delta S_ {fold} [/ math] y [math] \ Delta G_ {fold} [/ math] para el plegado de Klenow y Klentaq a 37 ° C (datos de la Fig. 4 ). Mientras que [math] \ Delta H_ {fold} [/ math] es la fuerza impulsora favorable para el plegamiento de ambas proteínas, Klentaq [math] \ Delta H_ {fold} [/ math] es significativamente más pequeño que Klentaq, y Klentaq’s extreme [math ] \ Delta G_ {fold} [/ math] se debe a su mucho más pequeña oposición [matemática] T \ Delta S_ {fold} [/ math].
- En la figura 4, puede ver que la estabilidad de Klentaq debajo de [matemática] 30 ^ {\ circ} C [/ math] es puramente entrópica, y de liberación de agua (ya que la contribución entálpica es positiva).
- Arriba de [math] 30 ^ {\ circ} C [/ math], las fuerzas motrices son entálpicas y entrópicas. Dado que las contribuciones entálpicas de Klenow son más favorables, la estabilidad de Klentaq a temperaturas más altas se puede atribuir a una menor penalización de plegamiento entrópico ([matemáticas] \ Delta S_ {conformación} [/ matemáticas])
Por lo tanto, podemos concluir que los cambios en la dinámica y la solvatación entre los estados plegado y desplegado podrían ser responsables de la estabilidad . Sin embargo, es muy difícil caracterizar experimentalmente los estados desnaturalizados.
Referencias
[1] Resistencias electrostáticas de puentes de sal en monómeros de glutamato deshidrogenasa termófilas y mesófilas.
[2] Pares de iones y la termotolerancia de proteínas de hipertermófilos: una “regla de tráfico” para carreteras calientes.
[3] Página en nih.gov
[4] La estabilidad de la ADN polimerasa Taq resulta de una penalización de plegamiento entrópico reducida; identificación de otras proteínas termófilas con fol … – PubMed – NCBI
[5] Aislamiento, caracterización y expresión en Escherichia coli del gen de la ADN polimerasa de Thermus aquaticus.
[6] Página en nih.gov
[7] Página en pnas.org
[8] Página en nih.gov
Nota al pie :
Gracias por esta pregunta En las últimas semanas, he leído algunos documentos excelentes que de otro modo no tendría.
