¿Cuáles son algunos de los inconvenientes de la tecnología de conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC)? ¿Qué tan fácil es modificar un anticuerpo existente para adjuntar una carga útil conjugada?

La tecnología de conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) tiene varias limitaciones que se vuelven claras al observar su historial de desarrollo y sus componentes.

¿Qué son los ADC?
Un ADC es un anticuerpo monoclonal (mAb, más comúnmente ratón, recientemente algún humano) + un enlazador (para unir [conjugado]) + un fármaco citotóxico de molécula pequeña (SMD, fármaco activo más antiguo, profármaco más nuevo).
De 1

Este sitio web que mantiene una lista completa y actualizada de anticuerpos terapéuticos y ADC:
IMGT / mAb-DB

¿Cuál es la idea detrás del ADC? Hace un siglo, Paul Ehrlich acuñó la frase magic bullet en el siguiente pasaje (2):
” Si imaginamos un organismo como infectado por cierta especie de bacteria, obviamente será fácil lograr una cura si se descubren sustancias que tienen una afinidad exclusiva por estas bacterias y actúan perjudicial o letalmente sobre ellas, mientras que al mismo tiempo tiempo que no poseen afinidad por los constituyentes normales del cuerpo y, por lo tanto, pueden tener el efecto menos dañino u otro efecto sobre ese cuerpo. Tales sustancias podrían entonces ejercer su acción completa exclusivamente sobre el parásito albergado dentro del organismo y representarían, por así decirlo, balas mágicas, que buscan su objetivo por su propia cuenta “.

Sustituya la célula tumoral por la bacteria de Ehrlich y el ADC se convierta en nuestro ejemplo oncológico sintético de su bala mágica, con la esperanza de que el mAb de ADC entregue específicamente su letal profármaco / fármaco asociado a un tumor que luego lo convierte químicamente y / o enzimáticamente en toxicidad, matando sí mismo en el proceso.

Un ADC viable requiere mucho trabajo (3, 4). Consideraciones importantes incluyen

1. ¿El ADC es estable en la sangre? Si no es así, el fármaco tóxico podría liberarse en el torrente sanguíneo y causar toxicidad sistémica.
2. ¿El mAb de ADC se une a su antígeno diana de la misma manera y con la misma afinidad? En otras palabras, el enlazador no debería modificar ni estructural ni funcionalmente la capacidad de unión a antígeno del mAb.
3. ¿El enlace compromete el mecanismo de acción del fármaco citotóxico? Hay dos clases principales de drogas ADC (1, 3, 5), las auristatinas y las maitansinas que se unen a los microtúbulos que conducen a la detención y apoptosis del ciclo celular en fase G2 / M, y las caliqueamicinas que se dirigen al ADN.
4. ¿Las células objetivo captan suficiente cantidad de ADC? Esto requiere un número suficiente de objetivos de anticuerpos (antígenos) expresados ​​en la superficie celular. Un número suficiente será diferente para cada antígeno y tipo de célula.
5. Una vez absorbido por el tumor, ¿hay suficiente cantidad de SMD liberada del ADC para matarla?
6. ¿Qué tan bien penetra el mAb en el tejido sólido? Los anticuerpos son notoriamente pobres al hacerlo. A esto se suman los resultados contraintuitivos de que la afinidad del anticuerpo y la penetración de la masa tumoral están inversamente relacionadas (6, 7), y tenemos una tarea bastante cuesta arriba ya que la mayoría de los mAb en el portafolio comercial se desarrollaron originalmente para afinidad alta, no baja.

Los anticuerpos tienen una amplia variedad de funciones efectoras que los hacen una herramienta versátil para tratar cánceres y enfermedades autoinmunes.

1. Neutralizan las toxinas (8, 9, 10).
2. Neutralizan las citoquinas (11).
3. Bloquean los receptores (12).
4. Se unen a los receptores de la superficie celular para impulsar la inmunidad específica (13), como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
5. Combinación de arriba (14).

Independientemente de estas múltiples funciones efectoras, en un ADC, el trabajo principal del mAb es simplemente dirigirse específicamente a un antígeno específico de la célula, es decir, funcionar como un vehículo dirigido de administración de fármacos para la droga tóxica, y poco más. ¿Algunos inconvenientes de los mAbs de ADC en ese sentido?

1. La mayoría de los mAbs candidatos se desarrollaron originalmente para una o más de las funciones efectoras enumeradas anteriormente, pero ahora se están cooptando como meros vehículos de entrega. Tal vez algunas de esas funciones efectoras se interponen en el camino de la entrega simple (15)? En este contexto, interponerse en el camino implica que participan en sus funciones efectoras y comprometen la seguridad del paciente. La elección del isotipo de mAb es, por lo tanto, clave. En retrospectiva, no es sorprendente que el formato de mAb más común sea IgG1, un isotipo muy bueno en la participación de ADCC. Después de todo, los mAb se desarrollaron para sus potentes funciones efectoras, no su destreza como vehículos para la administración dirigida de fármacos.
2. La mayoría de estos mAbs tienen una afinidad alta o muy alta, pero décadas después, la investigación sugiere que los mAbs con afinidades menores son mejor intuitivamente para penetrar tejidos sólidos como tumores (6, 7).
3. La mayoría de la cartera actual de más de 160 candidatos terapéuticos de mAb en ensayos clínicos para cáncer solo (16) se desarrollaron décadas atrás utilizando enfoques obsoletos, principalmente modelos de ratón, y luego se modificaron para uso humano mediante un proceso llamado humanización. Obviamente, es necesaria una modificación considerable para evitar respuestas inmunes humanas contra tales mAbs.

Modificaciones de anticuerpos
Hay dos procesos generales utilizados para modificar los mAbs para uso humano.
Humanización de anticuerpos
Reemplace la mayor cantidad posible de la secuencia de ratón del anticuerpo con su contraparte humana mientras conserva su propiedad de unión original.
Desinmunización
Identificar y reemplazar los epítopos de células T del anticuerpo.

Ambos métodos son falibles, laboriosos y requieren un gran esfuerzo.
¿Qué hace la humanización de mAb?

1. Reduce las respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón. Obviamente bueno para un mAb ADC.
2. Aumenta la semivida en la sangre del mAb. Obviamente es bueno para un mAb ADC.
3. Mejora la capacidad del mAb para provocar inmunidad. Para un mAb de ADC que debería servir como nada más que un vehículo confiable de administración de fármacos dirigida, no tan bueno. Por ejemplo, los mAbs de ratón convertidos a IgG humanas se retienen más tiempo en la circulación sanguínea a través de la unión al receptor de Fc neonatal humano (FcRn), que también potencia su capacidad de provocar ADCC (4).

Aunque se generan mAbs terapéuticos más nuevos usando tecnologías más recientes como bibliotecas de presentación en fagos o ratones humanizados (ratones transgénicos genéticamente modificados para producir anticuerpos humanos, no de ratón) como Mapatumumab de Cambridge Antibody Technology Ltd para cáncer colorrectal refractario (17), la humanización sola no es suficiente para asegurar una función ADC óptima, y ​​tampoco elimina las respuestas inmunes no deseadas contra el ADC mismo. Un ADC es un producto biofarmacéutico terapéutico diseñado para no generar una respuesta inmune tanto como para entregar una carga mortal a un objetivo específico. Por lo tanto, inducir respuestas inmunes contra sí mismo anula la utilidad del ADC. Los ADC podrían adquirir atributos inmunogénicos no deseados e indeseables, es decir, la capacidad de inducir una respuesta inmune, durante los procesos de cultivo y fabricación. Estos incluyen atributos como glicosilación y agregación, que solo se revelan empíricamente, es decir, a través de prueba y error.

Glicosilación
Una modificación postraduccional común y complicada, la glicosilación enzimáticamente agrega glucanos a las proteínas.

1. La glicosilación influye tanto en las propiedades físico-químicas (carga eléctrica, masa, estabilidad, estructura, tamaño, solubilidad) como biológicas (actividad, vida media, función del receptor) de una proteína tal como un mAb.

   a) La glicosilación adecuada es crítica para la función efectora del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos IgG modificados genéticamente que carecen de oligosacáridos fucosilados tenían una ADCC potenciada tanto in vitro como in vivo (18), un atributo deseable para un mAb terapéutico, no tanto para un mAb ADC.

   b) Glicosilación es específica de la especie.

2. Los seres humanos producen respuestas inmunes a la glucosilación no humana como galactosa-α1, 3-galactosa (α-Gal), ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) [común en cerdos y ratones] y beta1, 2-xilosa (núcleo-xilosa) y α1, 3-fucosa (core-α1, 3-fucosa) [común en las plantas]. Esto incluye anticuerpos IgG circulantes que implican una inmunidad completa que implica la activación de las células T y B seguida de la ayuda de las células T para las células B que conducen el cambio de clase de anticuerpos de IgM a IgG. Las líneas celulares y las condiciones de cultivo utilizadas para la síntesis de proteínas influyen en su patrón de glicosilación (19). Por ejemplo, cetuximab es un mAb de IgG1 humano de ratón quimérico aprobado para cánceres de cabeza y cuello de células colorrectales y escamosas. La línea celular de ratón SP2 / 0 utilizada para producir cetuximab expresa el gen que codifica la α1,3-galactosiltransferasa, la enzima responsable de la síntesis del epítopo α-Gal. Polémicamente, las células de ovario de hámster chino (CHO) podrían no sintetizar el epítopo α-Gal (20, 21). Además de las líneas celulares de mamíferos usadas para fabricar mAb, el propio medio de cultivo podría proporcionar los azúcares inmunogénicos si contuviera materiales derivados de animales ya que la célula podría incorporar metabólicamente dichos glicoepítopos en el mAb secretado (22).

Modificado de 19.

Agregación
Los cambios conformacionales que conducen a la agregación son un proceso clave que podría conferir inmunogenicidad en productos biofarmacéuticos como los ADC.

Desde 19

Si bien la glucosilación y la agregación son inconvenientes comunes a otros productos biofarmacéuticos, los inconvenientes adicionales de los ADC incluyen la falta de antígenos específicos de tumores definidos de manera estricta, poca capacidad de internalización por tumores y farmacología extremadamente complicada que incluye PK (farmacocinética) / PD (farmacodinámica) y ADME (Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción).

Antígenos específicos de tumores
¿Cuál es el objetivo del mAb en el ADC? El mejor de los casos es cuando el objetivo se expresa solo por una célula tumoral y no por ninguna otra célula normal del cuerpo. Dicha expresión específica de tumor es extremadamente rara, especialmente entre pacientes. Además, de los> 160 mAb terapéuticos que se están probando o aprobando, menos de un puñado son rigurosamente específicos del tumor. Los raros ejemplos son el linfoma de células B (anti-CD20; 23), el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2 o Erb-B2) dirigido por Trastuzumab (24), CD30 para el linfoma de Hodgkin y MUC16 para el cáncer de ovario (1) . Esto pone de relieve uno de los inconvenientes más importantes de la cartera actual de mAbs utilizados en los ADC. Con pocas excepciones, la mayoría de estos se generaron años o incluso décadas atrás, cuando los métodos de identificación eran mucho más primitivos, mucho menos sensibles y excesivamente dependientes del ratón y otros modelos animales, dejando abiertos si un objetivo de mAb es estrictamente específico del tumor. (24) Incluso ahora, ¿cómo se evalúa la expresión del antígeno y en qué? La inmunohistoquímica de muestras de pacientes in situ sería bastante óptima, pero en la práctica, incluso ahora más comúnmente, la evaluación implica líneas celulares y modelos de tumores de xenoinjertos (1). Con las líneas celulares, las condiciones de cultivo introducen otro gran artefacto. Tal falta de especificidad sobre el antígeno diana abre la puerta a una longitud cuestionable de la ventana terapéutica (25), es decir, cuando existe una expresión diferencial máxima del antígeno diana entre el tumor y el tejido normal (25, 26, 27) para maximizar el índice terapéutico (dosis máxima tolerada / dosis eficaz mínima).

Internalización
¿Con qué eficacia los mAbs utilizados en los ADCs son absorbidos por los tumores? Después de todo, estos mAbs se desarrollaron para funciones efectoras inmunes, y no para ser internalizados. Es más por casualidad que por diseño que algunos como Trastuzumab inducen la captación (28).

Farmacología
Extremadamente complicado por decir lo menos. ¿Por qué? El tipo de cadena pesada de mAb (isotipo), glicosilación, vía de administración, afinidad, ubicación y número de antígenos de superficie (objetivos de mAb), inmunogenicidad del ADC, estabilidad del CAD en circulación dotada por el enlazador son solo algunos de los factores que influyen. ADME y PK / PD de un ADC típico (29, 30, 31, 32).

¿Qué tan fácil es modificar un anticuerpo existente para adjuntar una carga útil conjugada?

Como muestra el historial de los mAbs quiméricos y humanizados, los mAb existentes pueden modificarse considerablemente. Por el contrario, a pesar de que los avances en la tecnología ADC Linker han mejorado enormemente la estabilidad, la clave del problema de la síntesis de ADC es garantizar una mezcla reproduciblemente homogénea de mAb-fármaco, es decir, el mismo número de moléculas de fármaco por mAb.
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Los ADC tempranos tenían enlazadores inestables con vidas medias tan cortas como de 1 a 2 días, por ejemplo, disulfuros (34, 35, 36) e hidrazonas (37, 38). Los nuevos enlazadores con mejor estabilidad y semividas más largas incluyen enlazadores peptídicos (39, 40) y glucurónidos (41). En términos generales, los enlazadores son escindibles o no escindibles (42).
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Los enlazadores divisibles dependen de tres tipos de procesos intracelulares para la liberación, concretamente, escisión del enlace dipéptido enlazador por proteasas lisosómicas tales como catepsina B (por ejemplo, Adcetris), hidrólisis del grupo lábil ácido enlazador tal como hidrazona dentro del pH ácido bajo del lisosoma ( por ejemplo, Mylotarg) o la reducción de enlaces disulfuro del enlazador por la concentración intracelular más alta de glutatión (por ejemplo, SAR3419, IMGN901, AVE9633). Con los enlazadores no escindibles, el anticuerpo se escinde proteolíticamente para liberar la toxina y su enlazador unido (p. Ej., Kadcyla) (43, 44). Los enlazadores no escindibles son más estables en circulación en comparación con los escindibles (1).
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¿Cómo decidir qué enlazador usar? Estudios preclínicos in vitro e in vivo (principalmente modelo de ratón) muestran cómo se absorbe y se degrada un ADC. Esa información más la información sobre la celda objetivo determina la elección del vinculador. Si bien el campo ha pasado de la conjugación problemática aleatoria a la conjunción de sitio más controlada, no existe una solución única para todos. Cada mAb, cada tumor requiere la optimización de un sistema de administración específico (3). Esto se suma al costo general.

¿Cuántas moléculas de fármaco se unen por mAb para un ADC óptimo? Más conectado, más rápido el ADC es despejado por el cuerpo. Dos a cuatro drogas por mAb funcionan mejor (45). La mayoría de los enlazadores se unen mediante residuos de cisteína o lisina en el mAb. Un anticuerpo típico tiene 80 lisinas y 20 cisteínas. ¡Eso es un montón de posibles sitios de conjugación! A pesar de ajustes tales como añadir residuos de cisteína adicionales (46), reemplazar cisteínas accesibles con solventes con serinas (47) o agregar aminoácidos no naturales (nnAA) como sitios de conjugación específicos (48), cargando reproduciblemente el mismo número de fármaco por mAb ha resultado esquivo (45) ¿Qué sitio en un mAb produce el ADC conjugado más homogéneamente? Esto también permanece sin respuesta hasta el momento para cualquier ADC.

Otro aspecto desconcertante de los mAbs es su poca eficacia (16). Por ejemplo, el Kadcyla recientemente aprobado requiere 160 mg por dosis (33). ¿Por qué cantidades tan altas? ¡Debido a que solo se estima que 1 a 2% de la dosis administrada de un ADC dado alcanza el sitio del tumor (49)! Obviamente, en lugar de personificar más por el dinero, los ADC hacen lo contrario. ¿Son las rutas (típicamente subcutáneas o intravenosas) de la administración las culpables o es algo totalmente diferente? En el caso de tumores sólidos, ¿deberíamos tratar de inyectarlos directamente en el tumor, por ejemplo?

Otros problemas de fabricación
Los ADC aprobados requieren sistemas de expresión y biorreactor de mamíferos con procesos de producción ascendentes y descendentes muy costosos. Los sistemas de expresión de proteínas libres de células contribuirían a mitigar los numerosos inconvenientes de los sistemas de expresión de células de mamíferos para la fabricación de mAb (50, 51, 52) aunque este es territorio virgen que requiere mucha optimización para reducir inmunogenicidad, y probablemente años fuera de la comercialización y aprobación regulatoria.

¿Qué pasa con la parte SMD del ADC? Los fármacos citotóxicos utilizados en los ADC son de 100 a 1000 veces más citotóxicos que los fármacos anticancerígenos tradicionales y, de hecho, eran demasiado tóxicos como los solitarios, pero se volvieron factibles como cargas útiles de ADC (1, 3, 5). Esta citotoxicidad muy mejorada aumenta enormemente la carga de diseñar procesos y sistemas de fabricación apropiados para mitigar y minimizar específicamente la exposición ocupacional durante la fabricación.

Como inmunólogo, ¿cuál es mi línea de fondo sobre ADCs y productos biofarmacéuticos similares? Es más fácil decirlo que hacerlo con la ingeniería de una salida inmune no deseada.

Bibliografía

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Gracias por la A2A, Adriana Heguy.