La incorporación de proteínas de membrana en los liposomas es más un arte que una ciencia. Requiere bastante paciencia y debes probar varios métodos y ver cuál funcionará mejor para tu proteína particular. No todos los métodos se pueden usar para todas las proteínas.
Existen esencialmente cuatro mecanismos actualmente conocidos para incorporar o reconstituir proteínas de membrana en liposomas.
1) Métodos que implican el uso de un solvente orgánico.
2) Métodos que implican el uso de los medios mecánicos.
3) Métodos que implican el uso de detergentes.
4) Incorporación directa de la proteína en los liposomas preformados.
Estas técnicas se describirán brevemente en las siguientes secciones.
- Reconstitución medicada con solvente orgánico
Los disolventes orgánicos se han usado ampliamente para preparar grandes liposomas en procedimientos que incluyen la inyección de etanol, la infusión de éter y la evaporación en fase inversa. Sin embargo, la utilidad de estas técnicas es limitada debido a la exposición de las proteínas de membrana a los solventes orgánicos, que a menudo los desnaturaliza.
El único método adecuado informado hasta la fecha para la reconstitución medicada con disolvente orgánico de proteínas de membrana es la evaporación de fase inversa. Szoka y Papahadjopoulos desarrollaron una técnica para la incorporación de proteínas de membrana en liposomas unilamelares grandes después de la extracción en un disolvente de hidrocarburo junto con fosfolípidos. La proteína de membrana se agregó a una
suspensión de lípidos en un tampón adecuado y luego un disolvente, por ejemplo, hexano, pentano,
se añadió diisopropil-éter y dietil-éter y la mezcla se sometió a sonicación durante unos minutos bajo argón. Después de la eliminación del disolvente orgánico en un evaporador rotativo, se forman los liposomas unilaminares grandes de aproximadamente 1 micrómetro. Los aspectos críticos de esta técnica son la selección del disolvente orgánico así como la relación de volumen de fase acuosa a no acuosa.
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- Reconstitución por medios mecánicos
El segundo método usa medios mecánicos para producir vesículas unilaminares grandes y pequeñas (ULV) a partir de vesículas multilamelares (MLV) hinchando las películas de fosfolípidos secos en un exceso de tampón. Tales medios mecánicos incluyen sonicación de MLV y forzamiento de vesículas lipídicas multilaminares a través de una prensa francesa. La sonicación y la congelación y descongelación de una suspensión mixta de lípidos y proteínas aisladas se han utilizado ampliamente en etapas tempranas de la reconstitución de proteína de membrana para demostrar la función de estas proteínas purificadas para las cuales la diálisis con detergente era insuficiente.
Las eficiencias de incorporación generalmente son bajas usando esta técnica. La proteína también se desnaturaliza durante el proceso.
- Reconstitución mediante el uso de detergentes
De los varios métodos diferentes utilizados para eliminar el detergente de la mezcla de detergente, fosfolípido y proteína, el procedimiento de diálisis ha demostrado ser muy exitoso. En dicho método, la proteína y los fosfolípidos se co – solubilizan en un detergente para formar micelas. A continuación, se elimina el detergente, dando como resultado la formación espontánea de vesículas bicapa con la proteína incorporada en el mismo. El detergente se incorpora a los liposomas así como a la proteína y, por lo tanto, estos métodos requieren la eliminación del detergente mediante métodos tales como diálisis, cromatografía de exclusión en gel o absorción sobre resinas hidrófobas. El método que usa detergente es muy lento porque la eliminación del detergente debe ser lo más completa posible. Además, un cambio de fase que tiene lugar durante este proceso ralentiza aún más la eliminación de detergente. Otra desventaja es que no se puede controlar la orientación de la proteína incorporada en los liposomas usando métodos de detergente.
El aspecto crítico de esta técnica es la selección de un detergente con la concentración micelar crítica (CMC) adecuada. Se recomienda utilizar un detergente con una CMC elevada, como Octyl-bD-glucopiranósido, que tiene una CMC de 20-26 mM.
Los detergentes con alta CMC pueden eliminarse fácilmente de la mezcla mediante diálisis.
- Incorporación directa de proteínas en el liposoma preformado
El cuarto proceso implica la incorporación directa de proteína en liposomas preformados. Una de las características clave para la incorporación exitosa de las proteínas deslipidadas en los liposomas preformados parece ser la organización de la bicapa. La bicapa conductora a la incorporación espontánea de proteínas de membrana grandes se logra incorporando impurezas tales como ácidos grasos, lisofosfolípidos, colesterol, detergente y proteínas unidas a la membrana. El efecto putativo de las impurezas es la formación de defectos organizativos que actúan como sitios para la fusión de vesículas con las proteínas.
