La respuesta completa a esta pregunta está básicamente aquí en este documento de 2002 del laboratorio Tsien: una proteína fluorescente roja monomérica. Aquí hay un resumen:
Desventajas de DsRed de origen natural:
- Maduración lenta e incompleta – Retraso en la observación en fluorescencia
- Obligar a la tetramerización: puede afectar la localización y la función de la proteína de interés
Intentos anteriores para mejorar DsRed:
- Variante DsRed T1 – Madurado más rápido, pero aún tetramerizado .
- HcRed1 (Clontech) – Convertido a un dímero por una única mutación de interfaz, pero todavía estaba limitado por un bajo coeficiente de extinción y un rendimiento cuántico.
Estrategias utilizadas para monomerizar DsRed:
Representación gráfica del tetrámero , dímero y monómero de DsRed basado en la estructura cristalina de rayos X de DsRed. Los residuos 1-5 no se observaron en la estructura cristalina (identificación del banco de datos de proteínas 1G7K) pero se han agregado arbitrariamente por el bien de la representación. El cromóforo DsRed se representa en rojo, y las cuatro cadenas del dímero se marcan siguiendo la convención de Yarbrough et al . ( A ) El tetrámero de DsRed con todos los residuos mutados en T1 indicados en verde para residuos externos y azul para aquellos internos al barril β. ( B ) El dímero de AC de DsRed con todas las mutaciones presentes en el dímero 2 representado como en A y el engarce de intersubunidad presente en tdimer2 (12) mostrado como una línea de puntos. ( C ) El monómero de DsRed con todas las mutaciones presentes en mRFP1 representado como en A.
1) Evolución de un dímero de DsRed
Tetrameric DsRed está dispuesto como un dímero de dímeros, con las cadenas A y B interactuando a través de grandes parches hidrofóbicos enterrados que consisten en pequeñas cadenas laterales, y las cadenas A y C hacen contactos cercanos a través de sus superficies y terminales C, que consisten principalmente en sal puentes, enlaces de hidrógeno e interacciones aromáticas.
Los esfuerzos iniciales fueron realizados por el grupo para interrumpir la interfaz de CA, pero estos resultaron consistentemente en proteínas no fluorescentes. Sin embargo, la interfaz AB podría romperse fácilmente con la única mutación I125R para dar un dímero fluorescente poco rojo que requirió más de 10 días para madurar por completo.
Para reconstituir la fluorescencia roja de DsRed-I125R , el grupo mutagenizó aleatoriamente la proteína para identificar residuos que afectan la maduración y el brillo de la proteína, pero no fue del todo exitosa. Alrededor de este tiempo, se publicó un estudio de Nature Biotech que informó una variante tetramérica T1 que maduró aproximadamente 15 veces más rápido que DsRed. Sin embargo, cuando el grupo introdujo la mutación I125R en T1, la proteína resultante tardó mucho más en madurar. Este T1-I125R (también conocido como dímero1 ) se utilizó luego como una plantilla para la mutagénesis aleatoria adicional para identificar mejores variantes, y se realizaron un total de cuatro exámenes sistemáticos hasta que se identificó que la variante dímero2 era la mejor proteína fluorescente dimérica (con una total de 17 mutaciones adicionales).
2) Construcción de un dímero en tándem de DsRed:
Suponiendo que un verdadero monómero de DsRed podría ser imposible, el grupo decidió fusionar dos copias del dímero AC con un enlazador polipeptídico de modo que las interacciones del dímero crítico pudieran satisfacerse a través de contactos intramoleculares con el compañero tándem codificado dentro del mismo polipéptido. Esto dio como resultado la construcción en tándem con un enlazador de 12 residuos, tdimer2 (12) , que era casi idéntico al dímero2.
3) Evolución de un monómero de DsRed:
El grupo decidió volver a la variante T1-I125R e intentó interrumpir los contactos de la interfaz de CA. realizando un escaneo dirigido del sitio. En la primera proyección, la E. coli más brillante las colonias se dejaron madurar a temperatura ambiente durante 2 semanas, y un análisis de proteína bruta reveló una única banda fluorescente débil al tamaño esperado de DsRed monomérico. Este monómero se sometió luego a una evolución dirigida adicional durante seis iteraciones, lo que dio como resultado una mejora drástica en el brillo y la velocidad de maduración. El clon final, designado mRFP1 contiene un total de 33 mutaciones en relación con el DsRed original.
Tabla 1: Resumen de datos espectroscópicos para diferentes variantes.
Tabla 2: Resumen de las bibliotecas construidas durante la evolución del dimer2 y mRFP1
Fuentes:
- Una proteína fluorescente roja monomérica
- Estructura cristalina refinada de DsRed, una proteína fluorescente roja de coral, con una resolución de 2,0-Å
- Variantes de maduración rápida de la proteína fluorescente roja Discoma (DsRed)
