Existen varios métodos para evaluar cuantitativamente y cualitativamente los estados de ubiquitinación de las proteínas. Enumeraré algunos aquí:
Enfoque basado en la proteómica:
Los métodos basados en proteómica, como la espectrometría de masas, son las formas más fáciles de medir los estados de ubiquitinación global de la célula. Una estrategia simple para identificar proteínas ubiquitinadas dentro de un tipo de célula particular podría ser:
- Cosecha el proteoma celular.
- Enriquezca las proteínas ubiquitinadas mediante el uso de purificación por afinidad basada en anticuerpos.
- Digerir esta fracción y analizar por MS.
Este método se puede modificar de varias maneras según el objetivo de la investigación. Algunas aplicaciones incluyen:
- Identificación de la ubiquitinación en una sola proteína
- Ubiquitinación específica de la etapa del ciclo celular
- Determinación del estado de ubiquitinación
Más detalles aquí: identificación proteómica de eventos de ubiquitinación de proteínas
Enfoque bioquímico:
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¿Qué motivos de aminoácidos hacen que una proteína sea susceptible de fosforilación?
Western Blot es quizás el rey de todos los ensayos de ubiquitinación en el hogar. Dado que es relativamente fácil de realizar, se puede utilizar para identificar grandes cantidades de información sobre los estados de ubiquitinación dentro de un sistema, especialmente con un poco de creatividad provista por el investigador.
La aplicación más comúnmente utilizada de WB es identificar la ubiquitinación de una proteína particular. La estrategia más simple es inmunoprecipitar la proteína de interés y detectar su ubiquitinación mediante el uso de un anticuerpo contra la ubiquitina. Los inhibidores de proteasoma, como el medicamento MG132, se utilizan con frecuencia para mejorar la ubiquitinación detectada. Este método puede proporcionar información como:
- Sitio de modificación
- Estado de ubiquitinación
- Ubiquitinación específica de la etapa del ciclo celular
- Alcance de la ubiquitinación
- Muchas otras cosas …
Aquí hay un ejemplo representativo de cómo detectar la ubiquitinación en una mancha:
La mancha a la izquierda muestra las proteínas de interés que se conjugaron con la etiqueta HA y luego se inmunoprecipitaron. La mancha a la derecha muestra que la ubiquitina FLAG que se adjuntó a las proteínas podría detectarse como múltiples bandas mucho más grandes que la proteína, lo que indica poli ubiquitinación.
Fuente de la imagen: los efectos antiproliferativos del CHFR dependen del dominio asociado de Forkhead, pero no de la actividad de la ligasa E3 mediada por el dominio del dedo anular
Enfoque cuantitativo:
ELISA es un buen método para detectar cuantitativamente la extensión y las tasas de ubiquitinación mediante una ubiquitina ligasa sobre un sustrato de interés. Se pueden usar varios kits de ELISA disponibles en el mercado para analizar el grado de ubiquitinación (kits ELISA de ubiquitina).
