A pesar de su eficacia, la PCR a menudo encuentra problemas como la PCR de salto que puede llevar a cuestionar la autenticidad de las secuencias amplificadas. La PCR de salto es la integración de fragmentos rotos en una cadena más larga para permitir que tenga lugar la técnica de “PCR convencional” (Paabo et al., 1989). Imagina que hay muchos fragmentos de una hebra de ADN. El cebador reconocerá e hibridará con su fragmento complementario y permitirá la extensión de ese fragmento mediante la polimerasa Taq . Como el Taq la polimerasa llega al final del fragmento, buscará otro fragmento que permita otra hibridación. Si se encuentra la coincidencia, el cebador ‘saltará’ a ese fragmento y continuará extendiendo el filamento hasta que se reforme el filamento original. Finalmente, se formará una secuencia bicatenaria más larga. Esta cadena recién sintetizada se usará entonces en la técnica de PCR ordinaria para una mayor amplificación (Paabo et al., 1989). Sin embargo, esto se vuelve problemático cuando se trata de fragmentos rotos de más de un tipo de ADN lineal como en el caso de individuos heterocigotos. En tales casos, dos conjuntos de ADN están presentes en el individuo. Habría una mezcla de diferentes fragmentos de diferentes cadenas lineales de ADN. La cadena resultante, por lo tanto, no será representativa del organismo en estudio. Este problema es aún más grave cuando se trata de ADN antiguos, que están muy fragmentados. Esto se observa en el estudio de las secuencias de ADN de los neandertales. Algunas de las moléculas de ADN que llevan sustituciones que se amplificaron en ciclos anteriores se recombinaron por medio de la PCR de salto, dando como resultado cambios en la secuencia de ADN (Krings et al., 1997).
El rendimiento de la técnica de PCR también se ve afectado por la contaminación. La contaminación generalmente es inevitable en el estudio del ADN antiguo. Siempre existe la posibilidad de que la secuencia de nucleótidos amplificada no se derive del ADN perteneciente al espécimen antiguo sino a algún material contaminante como el ADN humano moderno u otro ADN antiguo. Por inspección, si la secuencia amplificada de la especie en estudio difiere de la de sus parientes biológicos cercanos, entonces es más probable que la secuencia haya sido contaminada (Paabo et al., 1989). Esto se observa en una serie de estudios. En el estudio del quaqqa, las secuencias de ADN amplificadas demostraron que es un pariente cercano de la cebra, pero sus secuencias no son idénticas (Paabo et al., 1989). En el estudio dirigido por Woodward, las secuencias de ADN amplificadas de los huesos, que él cree que eran restos de un dinosaurio, no muestran ninguna correlación con las de aves, reptiles y mamíferos modernos (Gibbons, 1994). En cambio, se parecen a las secuencias de las bacterias modernas y las secuencias humanas. Esto, como lo señalaron muchos, podría deberse a la contaminación del hueso por un microorganismo desconocido en el pasado. Finalmente, tanto en el estudio del mamut siberiano de 40.000 años como en el de los huesos de Neandertal, se observaron hallazgos similares, pero en menor medida. Debido al manejo extensivo de la muestra por parte de los investigadores, se descubrió que los productos de PCR en ambos casos tienen un alto grado de contaminación por el ADN humano moderno (Krings et al., 1997). Las secuencias amplificadas ubican al mamut de Siberia en estrecha relación con los elefantes, pero no son idénticos a ellos (Paabo et al., 1989). En general, es más difícil detectar contaminaciones por secuencias no humanas que por secuencias humanas (Paabo et al., 1989). Por lo tanto, la autenticidad de la secuencia de ADN amplificada es a menudo cuestionable cuando se trata de muestras de ADN antiguas en las que la contaminación es un problema ineludible.
Por último, pero no menos importante, los daños del ADN antiguo también pueden afectar la autenticidad de la secuencia de ADN amplificada si se usa un número extremadamente pequeño de moléculas patrón para la amplificación (Krings et al., 1997). Algunos sitios pueden carecer de una base o enlace covalente inusual existente dentro de la cadena de ADN que podría ocurrir en estas moléculas dañadas (Paabo et al., 1989). Los sitios dañados generalmente ralentizan el proceso de amplificación y no se replican en absoluto. Sin embargo, ocasionalmente estos sitios dañados podrían ser incorporados incorrectamente por el TP y en lugar de leer el nucleótido adecuado, el TP simplemente sustituye aleatoriamente un dNTP libre a los sitios (Krings et al., 1997). Si se utiliza una muestra grande de la secuencia de la plantilla, este problema suele ser insignificante en comparación con la población resultante total (Paabo et al., 1989). Sin embargo, si la amplificación comenzó con muy pocas moléculas dañadas, los resultados amplificados se verán afectados. Las incorporaciones erróneas realizadas por el TP durante los primeros ciclos de la PCR afectarán a una gran parte de las moléculas en la ronda final (Krings et al., 1997). Esto es más evidente cuando las secuencias amplificadas de la misma plantilla tienen todas secuencias diferentes. Esto se observó en el estudio de los huesos de Neandertal. En el experimento, pudieron producir con éxito nueve secuencias limpias del objetivo, pero ninguna de las nueve secuencias es idéntica. La explicación más probable es que el TP podría haber insertado dNTP al azar cuando se encontró con un sitio dañado (Krings et al., 1997). Como resultado de estos daños, las secuencias resultantes no representan con precisión la secuencia original.
